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Scientific Reports 13권, 기사 번호: 6857(2023) 이 기사 인용

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바이러스 벡터는 세포 치료제 제조의 병목 현상을 나타냅니다. 전기천공법은 일차 세포의 비바이러스 형질감염을 위한 접근 방식으로 등장했지만 표준 큐벳 기반 접근 방식은 낮은 처리량, 어려운 최적화 및 대규모 세포 제조와의 비호환성 문제로 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 연구 및 공정 최적화를 위해 소량의 세포를 효율적으로 형질감염시키고 세포 치료 응용 분야에 필요한 용량으로 확장할 수 있는 신속하고 재현 가능한 전기 천공이 가능한 새로운 전기 천공 플랫폼을 제시합니다. 우리는 대조 세포에 비해 세포 생존력이 2% 미만 손실되면서 mRNA 전달을 위한 95% 이상의 형질감염 효율과 같은 높은 효율과 생존력으로 일차 인간 T 세포에 플라스미드 DNA 및 mRNA를 전달하는 방법을 보여줍니다. 우리는 2억 5600만 개의 세포/분의 실험 처리량을 달성하는 전달 확장 방법을 제시합니다. 마지막으로, 우리는 CRISPR/Cas9를 사용하여 T 세포 수용체(TCR) 발현을 녹다운하는 1차 T 세포의 치료 관련 변형을 보여줍니다. 이 연구는 세포 제조를 위한 T 세포의 효율적인 비바이러스 공학에 대한 충족되지 않은 요구 사항을 해결하기 위한 당사 시스템의 기능을 보여줍니다.

세포 치료법은 다양한 유전 및 후천성 질병을 치료할 수 있는 잠재력에 대한 열정을 불러일으켰습니다. 특히, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된 자가 T 세포를 활용하는 면역요법은 특정 혈액암에 대해 지속적이고 오래 지속되는 완화와 함께 놀라운 비율의 완전 반응을 달성했습니다. 고형 종양과 같은 다른 암을 치료하는 방향으로 연구가 진행되고 있습니다. 그러나 승인된 1세대 CAR-T 세포 치료법은 세포 재프로그래밍을 위해 렌티바이러스 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)와 같은 바이러스 벡터에 의존합니다1,2,3,4,5. 바이러스 벡터는 형질감염이 어려운 1차 인간 면역 세포의 고효율 형질도입을 가능하게 했지만 복잡하고 비용이 많이 드는 제조 공정, 면역원성 및 삽입 돌연변이 유발 가능성과 관련된 몇 가지 단점이 있습니다6,7,8. 또한 이 분야는 CRISPR/Cas9 기술을 통한 다중 유전자 편집 및 트랜스포존 요소에 의한 유전자 삽입과 같은 보다 복잡한 재프로그래밍 방법을 지향하는 추세이며, 이는 바이러스 접근 방식과 관련된 일반적인 포장 제한과 호환되지 않습니다9,10,11,12,13.

이러한 한계를 피하기 위해 연구 노력은 바이러스 전달을 대체하기 위한 비바이러스 형질감염 방법에 점점 더 집중해 왔습니다9,14,15. 비바이러스 형질감염 방법 중에서 전기천공법은 DNA, RNA 및 단백질을 세포에 전달하는 데 일반적으로 사용되는 잘 연구된 접근법으로, 바이러스 벡터 대체를 위한 주요 경쟁자로 인식되고 있습니다. 예를 들어, Bozza 등은 바이러스 접근법과 관련된 많은 단점을 우회하는 비통합 DNA 나노벡터를 사용하여 재조합 T 세포를 생성하기 위해 전기천공법을 사용하는 능력을 입증했습니다8. 마찬가지로, 전기천공법은 최근 유럽16에서 바이러스가 없는 CAR-T 세포와 piggyBac 시스템을 사용한 첫 번째 임상 시험을 위해 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 CAR-T 세포를 생성하는 데 사용되었습니다.

수년 동안 사용되어 온 표준 정적 전기천공 방법에서는 큐벳 내의 세포 현탁액에 고전압 전기 펄스를 적용하여 전기장이 생성됩니다18. 적용된 고전압 펄스는 분자가 세포로 확산될 수 있도록 세포막에 일시적인 구멍을 생성합니다19,20. 그러나 과도한 전기장 강도는 돌이킬 수 없는 세포막 파괴와 세포 사멸을 초래할 수 있습니다. 표준 프로세스에서 펄스 전압, 펄스 수 및 펄스 지속 시간은 분자 삽입 및 세포 생존의 효율성을 최적화하기 위해 경험적으로 다양한 매개변수 중 하나입니다. 경험적 최적화는 지루할 수 있으며 무엇보다도 전극에 대한 셀의 무작위 위치로 인해 프로세스에 가변성이 있을 수 있습니다. 또한 표준 큐벳 스타일 전기천공법은 대규모 또는 자동화된 세포 제조와 호환되지 않는 제한된 처리량을 가지고 있습니다. 따라서 바이러스 벡터 사용에 비해 잠재적인 이점이 이해되더라도 분자 전달 효율성, 세포 생존 가능성, 공정 가변성 및 제한된 처리량에 대한 제한으로 인해 이 방법의 광범위한 적용이 제한되었습니다.

90% (Fig. 3C, Figure S1A). Notably, we observed 95% ± 1.8% GFP expression from primary T cells derived from four healthy donors, while the viability ratio and relative yield were 98% ± 1.4% and 92% ± 6.6%, respectively (Fig. 3D, Figure S1B). Representative microscopic images of primary T cells expressing mRNA encoding GFP are shown in Figure S2. As such, these data demonstrate the capability of our platform to deliver mRNA at high efficiency without impacting cell viability./p> 98% for Jurkat, > 95% primary T cells) without significantly impacting cell viability or relative yield from our device. Our mRNA delivery performance exceeds values reported from cuvette-style electroporation devices and meets or exceeds the performance metrics from other microfluidic, non-viral transfection approaches27,28,29,30. For our comparisons to other approaches, including our transfections using the Gene Pulser system, it is important to note that experimental conditions can significantly alter transfection performance including cell preparation, cell and/or cargo concentrations, and choice of electroporation buffer31,32,33. Importantly, we were able to seamlessly scale mRNA delivery through increasing the concentration of cells in the electroporation buffer, the width of the channel, the flow rate, and the waveform frequency. The combination of these scaling methods enabled us to increase throughput up to 256 million cells/min using a channel width of 10 mm, a width that can be further expanded. Overall, our results indicate that increasing the width of our channel and using demonstrated flow, chemical, and electrical conditions that we can meet the required cell quantities for cellular therapies which often require greater than 1 billion cells14,34,35./p>